Научно-техническое обоснованеие космического эксперимента „Област” 1. Сущность исследовательской проблемы. Краткая история и состояние вопроса. Исследования на космических спутниках и станциях, в том числе проведенные нами совместно со специалистами России (Институт медико-биологических проблем, Москва), Нидерландов на биоспутниках “БИОН” и американской космической лаборатории “SLS-2”, показали, что костный скелет является одной из важнейших мишеней действия микрогравитации на организм. Установлено, что в этих условиях происходит уменьшение массы кости, прочности и минеральной насыщенности скелета, снижение интенсивности остеопластических и усиление резорбтивных процессов, особенно в костях, несущих опорную нагрузку. Потеря костной массы квалифицируется как клинически значимая остеопения (иногда остеопороз) (Morey-Holton et al., 1981; Газенко и соавт., 1986; Григорьев и соавт., 1994; Oganov V.S., 2006; Оганов В.С., Бакулин и др., 2005; Родионова Н.В., 1989, 2006; Rodionova N.V., Oganov V.S, 2009 и др.). Это является серьёзным фактором, лимитирующим длительность космических полётов. Остеопороз, обусловленный малоподвижным способом жизни (гипокинезия), в настоящее время рассматривается как «болезнь цивилизации». Несмотря на существующие разработки (Garetto et al., 1992; Григорьев А.И., Воложин А.И., 1994; Rodionova N.V., Oganov V.S., 2001; Родионова Н.В., Оганов В.С, 2001; Rodionova N.V., Oganov V.S., Zolotova N.V., 2002), остаются во многом не выясненными клеточные и тканевые механизмы развития, пролиферации и динамики дифференцировки остеогенных клеток в условиях снижения гравитационной нагрузки. Экспериментальными исследованиями показано, что в составе клеток стромы костного мозга, создающих регуляторное микроокружение для гемопоэтических клеток, имеется популяция мультипотентных мезенхимных стволовых клеток (МСК), способных к самообновлению и дифференцировке в фибробласты, ретикулоэндотелиальные клетки, остеогенные клетки, адипоциты в зависимости от локальных и системных факторов. Впервые МСК были выделены и описаны A.J. Fridenstein и сотрудниками (Fridenstein A.J., et al., 1978). С применением электронно-микроскопической радиографии с предшественником ДНК 3Нтимидином в развивающейся строме костного мозга in vivo нами (Родионова Н.В., 1989, 2006; Rodionova N.V., Oganov V.S., 2003;) описаны недифференцированные с характерной ультраструктурой интенсивно пролиферирующие и самообновляющиеся стромальные клетки. В зрелой строме костного мозга основная часть популяции этих клеток не включает 3Н-тимидин и находится в фазе Go клеточного цикла. Такие клетки имеют периваскулярную локализацию или связаны с сосудами отростками. Мы полагаем, что они представляют собой субпопуляцию клеток, способных к колониеобразованию в опытах in vitro и могут рассматриваться как претенденты на роль мультипотентных МСК. Стволовые клетки содержат репрессированные группы генов, способные к активации, которые определяют специфические синтезы для цитодифференцировки в нескольких направлениях. При переходе стволовых клеток в полустволовые (комитированные) активной становится лишь группа генов, которые определяют синтезы, специфичные только для одного направления цитодифференцировки. В частности, дифференцировка остеогенных клеток связана со снижением транскрипции генов, которые кодируют белки, участвующие в пролиферации, адгезии и повышении транскрипции генов остеобласт-специфических белков. Для зрелых остеобластов характерен синтез преимущественно коллагена І типа, костных морфогенетических белков (КМБ), факторов роста β (ТФРβ), а также фермента щелочной фосфатазы и др (Воложин А.И., Оганов В.С., 2005). Электронно-микроскопические исследования, в т.ч. проведенные нами (Родионова, 2006; Родионова Н.В., Оганов В.С., Бабак С.В., 2008), показали, что стромальные клетки (МСК), остеогенные клетки-предшественники, остеобласты и остеоциты при помощи отростков формируют стромально-остеоцитарный синцитий, структуру, обеспечивающую в костной ткани трансдукцию механических сигналов. Получены экспериментальные данные (Noble et al., 2003 и др.), что остеоциты первыми воспринимают изменения гравитационного поля и передают механические сигналы по стромально-остеоцитарной сети, и тем самым адаптируют (ремоделируют) остеогенетические и остеопластические процессы в костных структурах. Реакции МКС и их производных in vivo в системе остеоцит – клетки стромы в условиях космического полёта не изучены. Поэтому для раскрытия механизмов гравичувствительности клеток костной ткани актуальным является исследование стромальных клеток костного мозга in vitro при отсутствии остеоцитарных механических стимулов и системных факторов в условиях микрогравитации. Эксперименты на клеточных культурах с использованием различных методических подходов и маркеров специфических биосинтезов, проведенные на биоспутниках и в наземных условиях выявили, что остеогенные клетки гравичувствительны, показана тенденция к снижению дифференцировочных потенций клеток стромы костного мозга (Березовская, Родионова Н.В. 1998; Родионова Н.В., Богданович, 2005; Buravkova L. et al., 2005). Условия экспериментов и методические подходы различны, поэтому имеющиеся сведения во многом противоречивы. Так остаётся неясным – снижается пролиферативная активность мультипотентных МСК или происходит замедление дифференцировки остеогенных клеток-предшественников, имеет ли место изменение соотношения количества клеток различных направлений дифференцировки (остеогенных, адипоцитов, фибробластов). Ответы на эти вопросы важны для понимания, какие механизмы (перестройки) лежат в основе нарушений остеогенетических и остеопластических процессов, приводящие к развитию остеопенических явлений при микрогравитации. Планируемый космический эксперимент предусматривает с помощью комплекса современных методов исследования изучение в клеточных культурах стромы костного мозга, включающих остеогенные клетки-предшественники особенностей колониеобразования, цитологических и морфологических характеристик, пролиферативной активности, адгезивных свойств, направленности дифференциации, специфического функционирования, межклеточных контактов и т.д. Для выяснения механизмов гравитационно-зависимых реакций клеток стромы костного мозга необходимым является электронно-микроскопическое изучение состояния клеток: ядра и клеточных органелл (эндоплазматической сети, комплекса Гольджи, митохондрий, лизосомного аппарата, полисом, а также цитоскелета). Цитоскелет, как уже установлено в ряде исследований (Rodionova N.V., Shevel I.M. и др. 2000; Гершович и соавт., 2009 и др.) играет ведущую роль в механорецепции и механочувствительных реакциях клеток. Изучению изменений в ультраструктуре клеток стромы при микрогравитации будет уделено особое внимание, так как анализ научной литературы показал, что такие исследования малочисленны и малоинформативны. 2 Имеющийся у постановщика эксперимента «Област» опыт исследования остеогенных клеток в условиях КЭ, а также в наземных условиях позволяет обеспечить эффективную реализацию эксперимента. 2.Необходимость проведения КЭ в условиях космического пространства в составе РС МКС. Российский сегмент МКС (РС МКС) позволяет в полном объёме решить научные задачи космического эксперимента «ОБЛАСТ» с использованием установки «Биолаборатория М». 3.Описание КЭ 3.1 Порядок проведения КЭ Перед стартом клеточные культуры костного мозга крыс, находящиеся в биоконтейнерах, выдерживаются в термостате при температуре +37°С в течение 3 суток для адгезии клеток. После этого биоконтейнеры с культурами размещаются транспортировочном устройстве «Биолаборатории М» и доставляются на борт станции при температуре + 4°С. Активная часть эксперимента начинается сразу после размещения биоконтейнеров с культурами клеток в термостатах «Биолаборатории М» и на бортовой центрифуге (1 g) при температуре + 37° С (синхронный контроль). Длительность активного периода эксперимента (сеанса) 7-12 суток. Параллельно будут поставлен наземный контроль. В конце эксперимента космонавт-оператор выполняет манипуляции, связанные с химической фиксацией клеточных культур (ампула с фиксирующей смесью находится внутри биоконтейнера), а также помещает часть биоконтейнеров с культурами в термостат (+4°С) и холодильник (–15°С). По окончании эксперимента биоконтейнеры с культурами размещаю в холодильнике транспортировочного устройства «Биолаборатории М» при температуре (+4°С) и (–15°С) и доставляются на Землю. 3.2 Принципиальные требования к условиям выполнения КЭ Принципиальными требованиями к проведению, определяющими качество получаемой информации являются стабильность температурного режима термостата, холодильника, бесперебойное вращение центрифуги и соблюдение порядка проведения КЭ и доставка биоконтейнеров с культурами на Землю для целенаправленных исследований согласно научной программы. 3.3 Технические особенности НА НА «Биолаборатория-М» является многоцелевой, не имеющей зарубежных аналогов, аппаратурой для проведения биологических космических экспериментов широкого профиля. Она состоит из блоков, включающих следующие конструктивные модули: - бортовой термостат; - холодильно-морозильный блок; - центрифугу; - биоконтейнеры различной конфигурации; - устройство для фиксации биологического материала; - автономный блок питания; - цифровую камеру; 3 - кабели питания и кабели для подключения к ИУС; - комплект ЗИП. 3.4 Послеполетная обработка и анализ биообразцов После полёта будет проведена обработка биоматериала и сравнительный анализ полётных и контрольных (синхронных и наземных) клеточных культур с применением методов световой микроскопии, электронной микроскопии, фазово-контрастной, конфокальной и люминисцентной микроскопии, цитоиммунохимии, молекулярно-генетических методов и др., согласно научных задач. Планируются также провести послеполётные исследования клеточных культур с использованием специальных маркеров специфических биосинтезов для оценки пролиферативного и дифференцировочного потенциала, а также метаболической активности стромальных клеток костного мозга. Полученные в КЭ материалы будут проанализированы с использованием специализированных программ BioWizard, «Размер 5», Statistica 6.0. Комплекс методов и их научная информативность адекватны для решения поставленных задач. 4.Новизна, оценка качественного уровня по сравнению с аналогичными отечественными и зарубежными исследованиями. КЭ «Област» имеет научную новизну в плане постановки задач исследования и методических подходов. Высокий качественный уровень исследований предполагает получение новых по сравнению с имеющимися отечественными и зарубежными разработками данных о роли гравитационного фактора в дифференцировке остеогенных клеток-предшественников в составе стромы костного мозга. Результаты исследований позволят дать ответ на выдвигаемую исполнителями гипотезу о клеточных механизмах ремоделирования в костных структурах и направленности трансдукции механических сигналов в системе стромально-остеобластноостеоцитарного синцития костной ткани, внесут новое в понимание механизмов влияния факторов космического полёта на остеогенетические процессы в костном скелете и развитие остеопороза. 5.Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование (с указанием области применения). 5.1 Основные результаты Будут получены новые для науки данные о гравизависимых изменениях в стромальных клетках костного мозга, изучены их дифференцировочные потенции, а также особенности пролиферации, дифференцировки, специфического функционирования остеогенных клеток, некоторые механизмы их гравичувствительности. Проведен сравнительный анализ данных, полученных на клеточных культурах стромальных клеток с результатами исследований на тканевом и организменном уровнях для выяснения взаимодействия в остеогенезе локальных и системных факторов. 5.2 Предполагаемое использование результатов Результаты исследований об особенностях колониеобразования, ультраструктуры, дифференцировки и функциональных потенций МСК и их производных – остеогенных клетокпредшественников в условиях микрогравитации послужат основой для разработки методов диагностики и прогнозирования (тест-системы), а также коррекции патологических состояний костной ткани, в частности остеопении и остеопороза, развитие которых возможно в условиях 4 длительных космических полётов и при гипокинезии, которая в настоящее время рассматривается как экосоциальный фактор. Области применения: космическая медицина и биология, биотехнология, практическая и теоретическая медицина и биология. 6.Обоснование технических возможностей создания НА с заданными характеристиками. Соисполнители со стороны Украины имеют 35-летний опыт конструирования НА, которая успешно работала на станциях «Мир» и «Салют» и, опираясь на опыт и оригинальные идеи украинских ученых в области биологических космических исследований, владеют технической, технологической и кадровой инфраструктурой для создания аппаратуры «Биолаборатория-М» с заданными характеристиками. 7.Характеристика рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ. Риски и дискомфорт для экипажа в связи с выполнением эксперимента «Област» отсутствуют. Список цитируемой литературы 1. Buravkova L., Romanov Y., Grigorieva O, Merzlikina N. Cell-to-cell interaction in changed gravity: ground-based and flight experiments // Acta Astronaut, 2005. – 57 (2-8). – P. 67-74. 2. Garetto L.P., Morey E.R., Durnova G.N. et al. Preosteoblast production in Cosmos 2044 rats: shot-term recovery of osteogenic potential // J. Appl. Physiol. – 1992. – 73. – P. 14-18. 3. Fridenstein A.J., et al. Origin of bone marrow stromal mechanocytes in radiochimeras and heterotopic transplants // Exp. Hematol., 1978. – V. 6, № 5. – P. 440-444. 4. Morey-Holton E.R., Wronsky T.J. Animal model for simulating weightlessness // The Physiologist., 1981. – 24, N 6. – P.45-48. 5. Noble B.S., Peet E., Stevens H. et al. Mechanical loading: biphasic osteocyte survival and targeting of osteoclasts for bone destruction in rat cortical bone // J.Physiology – Cell Physiology. – 2003. – 284, N 4. – P.934-943. 6. Oganov V.S. The skeletal system, weightlessness, and osteoporosis. M., Firm "Slovo", 2006. – 256 p. 7. Rodionova N.V., Oganov V.S. Morpho-functional adaptations in the bone tissue under the space flight conditions // J. Gravit. Physiol., 2001. – vol. 7 (3). – p.72-73. 8. Rodionova N.V., Oganov V.S. Peculiarity of ultrastucture and 45Ca methabolism of osteoclasts in condictions of hind limb unloading and microgravity // Vestnik zoology, 2009. – 43 (4). – P. 305-313. 9. Rodionova N.V., Oganov V.S., Zolotova N.V. Ultrastructural changes in osteocytes in microgravity conditions // J. Advanc. Space Research, 2002. – vol. 30, № 4. – Р. 775-770. 10. Rodionova N.V., Oganov V.S. Changes of cell-vascular complex in zones of adaptive remodeling of the bone tissue under microgravity conditions //J. Advanc. Space Research. USA, 2003. – Vol. 32, № 8, – P. 1477–1482. 11. Rodionova N.V., Shevel I.M., Oganov V.S., Novikov V.E. Bone ultrastructural changes in Bion 11 Rhesus Monkeys. // J. Gravit. Phisiol., 2000. – vol.7. (1). – р 157-161. 12. Березовская О.П., Родионова Н.В. Влияние микрогравитации на остеогенные клетки in vivo. Ультраструктурные исследования // Цитология и генетика. – 1998. – 32, № 4. – С. 3-8. 5 13. Воложин А.И., Оганов В.С. (Ред) Остеопороз. // Практическая медицина, Москва 2005, 238с. 14. Газенко О.Г., Григорьев А.Н., Наточин Ю.В. Водно-солевой гомеостаз и космический полет // Проблемы космической биологии. – М.: Наука, 1986. – Т.54. – 240 с. 15. Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Цитоскелет и адгезия культивируемых стромальных клеток-предшественников костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации // Цитология. – 2009. – Том 51, № 11. – С. 896-901. 16. Григорьев А.И., Воложин А.И., Ступаков Г.П. Минеральный обмен у человека в условиях измененной гравитации. – М.: Наука, 1994. – Т.74. – 216 с. 17. Оганов В.С., Бакулин А.В., Новиков В.Е., Мурашко Л.М., Кабицкая О.Е. Изменения костной ткани человека в космическом полете. О возможных механизмах остеопении // Остеопороз и остеопатии, 2005. – №2. – С.2-7. 18. Родионова Н.В. Цитологічні механізми перебудов у кістках при гіпокінезії та мікрогравітації. – Київ: Наук. думка, 2006. – 239 с. 19. Родионова Н.В., Оганов В.С. Бабак С.В. Нестеренко О.Н. Ультраструктурные изменения в остеогенных клетках при действии факторов космического полёта // Український морфологічний альманах. – 2008. – Т.6, № 1. – С. 219-220. 20. Родионова Н.В., Оганов В.С. Цитологические механизмы развития остеопороза при действии факторов космического полёта // Проблемы остеологии. – Т.4 №1-2, Киев 2001. – 4, – С. 135-136. 21. Родионова Н.В.Функциональная морфология клеток в остеогенезе. – Киев: Наук. думка, 1989. – 186 с. 22. Родионова Н.В., Богданович Л.В. Колониеобразование стромальных клеток костного мозга крыс in vitro после экспериментальной гипокинезии // Укр. морф. альманах. – 2005. – № 1. – С. 5355. 6