Комплексное исследование мочи в следах на вещественных

На правах рукописи
УДК 340.6: 612.46 (021)
СИЛКИНА Светлана Юрьевна
КОМПЛЕКСНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЧИ В СЛЕДАХ
НА ВЕЩЕСТВЕННЫХ ДОКАЗАТЕЛЬСТВАХ
14.00.24 – «Судебная медицина»
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2008
2
Работа выполнена в ГОУ ВПО
«Нижегородская государственная медицинская академия
Росздрава»
Научный руководитель:
Заслуженный врач РФ, доктор
медицинских наук, профессор
Эделев Николай Серафимович
(ГОУ ВПО «Нижегородская государственная
медицинская академия Росздрава»)
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Тучик Евгений Савельевич
(Бюро судебно-медицинской экспертизы
департамента здравоохранения г. Москвы)
кандидат медицинских наук, доцент
Сундуков Дмитрий Вадимович
(ГОУ ВПО «Российский Университет
Дружбы Народов»)
Ведущая организация:
ГОУ ДПО «Российская медицинская акаде мия последипломного образования Росздрава»
Защита состоится «_____»_______________ 2008 года
в__________
часов на заседании диссертационного совета ДМ 208.041.04. при ГОУ ВПО
«Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127006, г. Москва, ул. Долгоруковская, д.4 стр.7 (кафедра
истории медицины).
Почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д.20/1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО
«Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127006, г. Москва, ул. Вучетича, д.10а.
Автореферат разослан «_____»____________________2008 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат медицинских наук, доцент
Т.Ю.Хохлова
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Постоянно
возрастающий
уровень
расследования
преступлений,
направленных против жизни, здоровья человека, повышает роль судебномедицинской экспертизы по исследованию следов биологического происхождения, в том числе мочи. А успехи в области биологии, генетики, иммунологии, цитологии создают базу и возможности развития новых медицинских технологий, направленных к решению основной задачи судебномедицинской экспертизы выделений в плане идентификации личности.
В судебно-медицинском плане следы мочи изучены недостаточно. В
частности, кроме определения её наличия, видовой и групповой принадлежности, другие исследования не проводятся (Барсегянц Л.О., Левченков
Б.Д., 1978; Барсегянц Л.О., 1999).
Следует отметить, что из данных о клиническом исследовании мочи
(Предтеченский В.Е., Боровская В.М., Марголина Л.Т., 1950) и единичных
публикаций в судебно-медицинской литературе (Escelund V., 1956; Riis P.,
Pilgaard C.E., 1956; Castro N.M., Sasso W.S., Trench U. S., Kerbany J., 1957;
Тишинова Л.А., 1988) известно, что осадок мочи содержит клеточные элементы.
Исследованию клеток посвящено множество работ отечественных и
зарубежных авторов (Jelacic O., 1964; Willeme-Pissart F., Moureau P., 1964;
Шалаев Н.Г., 1965, 1966,; Капустин А.В., 1969; Антонова С.Н., Митяева Н.А.,
1972; Федоровцева Л.С., Загрядская Л.П., Одинцов Н.В., 1977; Федоровцев
А.Л., Ревнитская Л.А., 1980; Еранов Н.В., 1981; Королева Е.И., 1985; Федоровцев А.Л., 2003), в которых отмечены возможности установления органнотканевой (региональной), видовой, групповой и половой принадлежности
изолированных клеток.
Тем не менее мы не нашли в судебно-медицинской литературе работ,
посвященных изучению клеточного состава осадка мочи.
4
Трудности в исследовании пятен мочи в экспертной практике связаны
ещё и с тем обстоятельством, что с мочой здорового человека выделяется менее 0,002 г/л белка (Данилова Л.А., 2002). Обычно этого количества белка
недостаточно для достоверного определения его видовой принадлежности
(Гуртовая С.В., 2001).
Таким образом, вышеизложенное подчеркивает актуальность работы и
определяет
ЦЕЛЬ
исследования
-
установить
возможности
судебно-
медицинского исследования клеточного осадка мочи и определения её видовой принадлежности.
В соответствии с целью поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1. Исследовать клеточный состав осадка мужской и женской мочи с
установлением региональной и половой принадлежности клеток.
2. Разработать способ диагностики половой принадлежности мочи по
соотношению в осадке ядросодержащих и безъядерных клеток.
3. Разработать оптимальные варианты определения групповой принадлежности клеток осадка мочи по системам АВ0 и MNSs.
4. Изучить устойчивость клеток осадка мочи к воздействию некоторых
факторов внешней среды: влажности, высокой и низкой температуры.
5. Разработать модификации постановки реакции встречного иммуноэлектрофореза на мембранах из ацетат-целлюлозы для определения видовой
принадлежности следов мочи.
6. Разработать комплексную методику исследования следов мочи на
вещественных доказательствах.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые установлена возможность определения региональной, групповой и половой принадлежности клеток осадка мочи.
Изучена сохраняемость клеток мочевого осадка в зависимости от воздействия различных факторов внешней среды (влажности, высокой и низкой
температуры).
5
Разработаны оптимальные методики определения видовой принадлежности следов мочи.
Предложена комплексная методика исследования пятен мочи в следах
на вещественных доказательствах.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Комплексное исследование следов мочи на вещественных доказательствах с изучением её клеточного состава в предложенном варианте существенно расширяет возможности судебно-медицинской экспертизы в плане
конкретизации экспертных выводов о происхождении мочи от определенного человека.
Найден эффективный и рациональный способ определения видовой
принадлежности мочи с использованием протеолитических ферментов и
предварительным накоплением белков на фильтровальной бумаге перед постановкой реакции встречного иммуноэлектрофореза на мембранах из ацетат-целлюлозы.
НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ:
1. Пятна мочи, как выделения, кроме жидкой части, содержат клетки,
исследование которых может использоваться для установления видовой, половой и групповой принадлежности мочи.
2. В моче практически здоровых людей содержится белок в достаточном количестве для определения его видоспецифических свойств.
3. Комплексное исследование пятен мочи с изучением клеточного состава осадка существенно расширит возможности судебно-медицинской экспертизы в плане конкретизации выводов о происхождении следов мочи от
определённого человека.
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ
Основные положения работы доложены на 5 заседаниях Нижегородского отделения Всероссийского общества судебных медиков (2001- 2007 г.
г.). На Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы судебно-медицинской экспертизы вещественных доказательств и Пле-
6
нума правления ВОСМ» (г. Воронеж, 2007 г.). На заседаниях кафедры судебной медицины ГОУ ВПО «НижГМА Росздрава» (2001-2008 г.г.).
ЛИЧНОЕ УЧАСТИЕ АВТОРА
Суммарное долевое участие автора на всех этапах работы составило 9095 %. Автором лично была проведена серия экспериментов по исследованию
образцов мочи от 150 практически здоровых человек, мужчин и женщин в
возрасте от 3 до 76 лет. Самостоятельно проведено 4000 экспериментов разных серий, изучено 800 цитологических препаратов осадка мочи.
Автором выполнено 12 практических судебно-медицинских экспертиз
по исследованию следов мочи на вещественных доказательствах.
ВНЕДРЕНИЕ
Разработанные методики по изучения клеточного состава пятен мочи,
определению её видовой и половой принадлежности внедрены в практику
работы судебно-медицинских экспертов – биологов и цитологов Нижегородского, Новосибирского, Самарского, Ярославского областных бюро судебномедицинской экспертизы, республиканских бюро судебно-медицинской экспертизы Республик Татарстан, Марий Эл, а также используются в учебном
процессе кафедры судебной медицины ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава».
ПУБЛИКАЦИИ
По теме диссертации опубликовано 7 журнальных статей, из них 1 в
журнале, рекомендованном ВАК России.
Получено положительное решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам о выдаче патента на
изобретение «Способ определения половой принадлежности мочи при судебно-медицинской экспертизе следов мочи» от 11 марта 2008 года.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация состоит из введения, 7 глав текста, заключения, выводов,
практических рекомендаций, списка литературы, 4 приложений. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц, 27 ри-
7
сунков. Список литературы включает 304 источника, из них 106 иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования
Для решения поставленных задач проведено 4000 экспериментов разных
серий,
самостоятельно
выполнено
12
практических
судебно-
медицинских экспертиз по исследованию следов мочи. Объём и характеристика экспериментов представлены в таблице 1.
Всего в процессе изучения экспериментального материала микроскопическому исследованию подвергнуто 800 цитологических препаратов осадка мочи, в 540 наблюдениях проведено определение видовой принадлежности мочи, в 2400 опытах осуществлено установление групповой (по системам
АВ0 и MNSs) дифференцировки клеток в осадке мочи, проведено 260 опытов
по изучению воздействия на клетки высокой, низкой температуры и влажности.
В экспериментах исследовали мочу 150 человек, взятую в разное время
суток в стерильную стеклянную посуду у практически здоровых добровольцев (110 женщин и 40 мужчин) в возрасте от 3 до 76 лет, у которых отсутствовал клинический анамнез по нефрологии. Образцы брались на протяжении 2 лет.
Одна часть мочи исследовалась в жидком виде, другая - в виде пятен,
высушенных на марле, сложенной в 8 слоев. Высушивание производили в
условиях вытяжного шкафа при комнатной температуре в открытых чашках
Петри. Высушенные образцы хранили в бумажных пакетах при комнатной
температуре. При заборе материала фиксировали цвет, фазу менструального
цикла у женщин, измеряли рН мочи с помощью индикаторной бумаги.
Кроме того, исследованию подвергали 30 образцов мочи самцов и самок кошек и собак в возрасте от 3 месяцев до 17 лет. Образцы мочи животных брали на марлю, высушивали и хранили при комнатной температуре.
8
Таблица 1
Количественная характеристика выполненных экспериментов
№№
1
2
3
4
5
6
7
Характер исследований
Определение видовой принадлежности жидкой мочи и её пятен
реакцией преципитации в агаровом геле
Определение видовой принадлежности жидкой мочи и её пятен
методом встречного иммуноэлектрофореза на ацетатцеллюлозных мембранах
Разработка модификации реакции преципитации в агаровом геле для определения видовой принадлежности мочи в пятнах после накопления белка и обработки 0,1% раствором трипсина или
папаина
Разработка модификации методики встречного иммуноэлектрофореза на ацетат-целлюлозных мембранах для определения видовой принадлежности мочи в пятнах после накопления белка и
обработки 0,1% раствором трипсина или папаина
Изучение морфологических особенностей клеток осадка мочи с
определением половой принадлежности методами:
- люминесцентной микроскопии
- световой микроскопии
Определение групповой принадлежности клеток реакцией смешанной агглютинации:
- по системе АВ0
- по системе MNSs
Изучение влияния некоторых факторов внешней среды на сохраняемость клеток осадка мочи:
- высокой температуры
- низкой температуры
- повышенной влажности
Всего
количество
220
220
50
50
400
400
1440
960
40
160
60
4000
Методика приготовления цитологических препаратов
Жидкую мочу центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об./мин.
Для удаления солей осадок помещали в 10 мл 15% раствора уксусной кислоты на 20 часов.
Вырезки из пятен мочи экстрагировали 10 мл 15% раствора уксусной
кислоты в течение 20 часов. Кусочки извлекали, отжимали, экстракт центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об./ мин.
9
Отмывание материала после экстракции осуществляли путем центрифугирования в 10 мл 15% уксусной кислоты при 1500 об./мин в 3 порциях
(по 10 минут в каждой).
Разведенный осадок помещали в виде капель на предварительно обезжиренные в смеси Никифорова предметные стекла, высушивали при комнатной температуре и фиксировали 96 этиловым спиртом.
Методики окраски препаратов
В наших исследованиях использованы 2 основных метода окраски препаратов, широко применяемых при проведении судебно-медицинских цитологических исследований. Это флюорохромирование препаратов растворами
акрихина и акридинового оранжевого.
Для более полного выявления морфологических признаков многослойного плоского неороговевающего эпителия были применены дифференцирующие окраски растворами амидочёрного 10Б и Люголя.
Флюорохромирование препаратов раствором акрихина
Для окраски препаратов раствором акрихина использована методика,
разработанная С.С.Киреевой (1976), в модификации Е.И.Королёвой (1983):
зафиксированные препараты в течение 10-15 мин. окрашивают 0,0005% водным раствором акрихина (в наших исследованиях использован акрихин производства фирмы «Bayer» под названием «атебрин») и 5-10 сек. промывают
проточной водой.
Флюорохромирование препаратов раствором акридинового оранжевого
Для флюорохромирования препаратов раствором акридинового оранжевого (АО) использована модифицированная методика L.Bertalanffy,
J.Bickis (1956), состоящая в следующем: зафиксированные препараты 2 мин.
окрашивают 0,01% раствором АО, приготовленном на фосфатном буфере с
рН 6,0, и 20-30 сек. промывают проточной водой. В данном случае обязательным является применение раствора красителя с рН 6,0, т.к., по данным
10
А.В.Зеленина (1967), именно при таком значении рН, обнаруживаются минимальные количества РНК в клетках.
Окрашивание препаратов раствором амидочёрного 10Б
В соответствии с методикой, предложенной А.Л.Федоровцевым
(2003), препараты 10 мин. окрашивали 0,05% раствором амидочёрного 10Б,
приготовленном на смеси Карнуа, и 10-15 сек. промывали проточной водой.
Окрашивание препаратов раствором Люголя
На препарат помещали 1-2 капли Люголя, накрывали покровным
стеклом и микроскопировали.
Условия и режимы микроскопии
Цитологические препараты изучали с помощью микроскопов ЛЮМАМ
Р-8 и МИКМЕД-2 вар.12, которые позволяют проводить исследования объектов, как в проходящем свете, так и в режиме люминесцентной микроскопии.
Люминесцентно-микроскопические исследования проводили в отражённом свете микроскопа, т.к. такой режим микроскопии позволяет изучать
непрозрачные объекты (Барский И.Я. с соавт., 1976). Кроме этого, объектив
при таком варианте микроскопии играет роль конденсора, в связи с чем,
освещённость препарата возрастает с ростом апертуры и увеличения объектива (Корн М.Я., 1977).
При изучении препаратов, окрашенных растворами акрихина и АО, использовали пропускающие светофильтры типа ФС-1 или СС-15 с толщиной
стекла 2-6 мм, выделяющие сине-фиолетовую область спектра, что позволяет
получить наибольшую яркость свечения объектов. В качестве запирающих
фильтров (которые полностью поглощают сине-фиолетовую область спектра)
применен светофильтр ЖС-18+ЖЗС-19 для микроскопа ЛЮМАМ Р-8 и ЖС18-4 для микроскопа МИКМЕД-2 вар.12.
Изучение клеток проводили с объективами водной иммерсии 40х, 60х,
100х и масляной иммерсии 100х, а обзорную микроскопию - с объективами
10-20х.
11
При окраске растворами Люголя и амидочёрного 10Б применяли световую микроскопию: объективы - 20х, 40х, окуляры - 10-15х.
Для фотографической регистрации наблюдаемой микроскопической
картины применяли цифровой фотоаппарат «OLYMPUS С-5060 Wide Zoom»
и компьютерную видеосистему «ВидеоТест 4,0».
Для математической обработки полученных результатов использовали
лицензированные и свободно-распространяемые статистические продукты
«Медицинская статистика», «STATISTICA вар.6», «MS-Excel». Полученные
данные заносили в статистическую оболочку программы, где и производился
расчет средних значений и среднеквадратических отклонений показателей.
Основные результаты исследования
Проведённые микроскопические исследования показали, что цитологическая картина препаратов мочи, полученной от мужчин и женщин, существенно различается по количеству и морфологическим особенностям клеток
эпителия, образующих её осадок. Так, в препаратах, приготовленных из мочи
лиц женского пола, число клеток было в 5 -10 раз больше, чем у мужчин.
В мужской моче превалировали безъядерные клетки поверхностного
слоя кожи (эпидермальные чешуйки). Встречаемость ядросодержащих клеток составила только 13,7 ± 9,3%. Эти клетки имели полигональную или
овальную форму и ровные не завернутые края. Ядра клеток преимущественно
овальной
формы,
чаще
располагались
эксцентрично,
ядерно-
цитоплазматический индекс (отношение величины ядра к наибольшему размеру клетки) составлял 1:4 – 1:10, что, по данным М.Г.Арсеньевой (1977),
свидетельствовало о наличии в препаратах клеток поверхностного и промежуточного слоёв многослойного плоского неороговевающего эпителия.
Кроме этих клеток, в одном наблюдении была найдена клетка переходного эпителия, а в двух наблюдениях – сперматозоиды.
При окрашивании препаратов раствором амидочёрного 10Б цитоплазма
ядросодержащих клеток приобретала неинтенсивный и равномерный светлосиний цвет, была мелкозернистой или бесструктурной, в ней у большинства
12
клеток различались мелкие (величиной около 2-3 мкм) черно-синие включения неправильной формы. В части клеток вокруг ядра имелась светлая зона –
«нимб».
Отмеченные
морфологические
особенности,
по
данным
А.Л.Федоровцева (2003), типичны для клеток многослойного плоского неороговевающего эпителия ладьевидной ямки мочеиспускательного канала.
При окраске клеток раствором Люголя были обнаружены единичные
гликогенсодержащие клетки (до 1-2 на препарат), что частично подтверждает
данные И.И.Ильина (1962) о наличии гликогена в клетках слизистой оболочки конечного отдела мочеиспускательного канала (ладьевидной ямке).
При исследовании клеточных ядер в 39,7  10,7% из них выявлен Yхроматин, наличие которого позволяет не только диагностировать мужской
генетический пол, но и одновременно определить видовое происхождение
мочи (Pearson P. et al., 1971; Blažek J., Bráza J., 1972; Загрядская А.П. с соавт.,
1977; Одинцов Н.В., 1979).
В препаратах, приготовленных из осадка женской мочи в каждом поле
зрения микроскопа выявлялось не менее 20-50 клеток. При этом в 87,4 ± 6,8%
из них содержались ядра, остальные клетки были представлены безъядерными эпидермальными чешуйками.
Ядросодержащие клетки имели полигональную и овальную форму,
мелкозубчатые края, у части – завернутые, ядра – округлые или овальные,
расположены преимущественно центрально (ядерно-цитоплазматический
индекс составлял 1:4 – 1:11) – клетки промежуточного и поверхностного слоёв многослойного плоского неороговевающего эпителия.
При окраске препаратов 0,05% раствором амидочёрного 10Б цитоплазма клеток окрашивалась интенсивно и неравномерно в синие тона, имела
грубозернистое строение, включения в ней или отсутствовали, или иногда
встречались мелкие (до 2 мкм) неправильной формы чёрно-синего цвета. Вокруг ядер в некоторых клетках отмечалась светлая зона – «нимб».
В препаратах, приготовленных из осадка мочи 11 женщин имелись немногочисленные клетки, цитоплазма которых была как бы «вспенена»: за-
13
полнена многочисленными пузырьками округлой или многоугольной формы,
центральная часть которых не окрашена. Данный признак, наряду с вышеописанными морфологическими особенностями, типичен, по данным
А.Л.Федоровцева (2003), для клеток влагалищного эпителия.
При люминесцентной микроскопии препаратов, окрашенных растворами атебрина или акридинового оранжевого, в 36,2  6,4 % ядер клеток промежуточного слоя выявлен Х-хроматин.
Х-хроматин был найден во всех случаях исследования клеток осадка
мочи от лиц женского пола, как в пятнах, так и в жидкой моче. При этом каких-либо различий в содержании Х-хроматина в ядрах клеток осадка мочи в
зависимости от возраста (3 - 76 лет), фазы менструального цикла у женщин, а
также давности пятен в пределах 3 дня – 1 год не выявлено.
При окраске препаратов раствором Люголя в цитоплазме 36,4  10,8%
клеток отмечено присутствие гликогена.
Более низкое содержание гликогена в вагинальных клетках по сравнению с исследованиями Н.Г. Шалаева (1966) и А.Л. Федоровцева (2003) можно объяснить разрушающим действием мочи (H. Wessel, E. Schwars, 1975).
Клетки переходного и призматического каёмчатого эпителия мочевыводящих путей не были найдены ни в одном из наблюдений.
Поскольку число ядросодержащих клеток, извлекаемых из следов мочи
у женщин оказалось значительно больше, чем у мужчин (различия статистически достоверны, t  4), был разработан способ диагностики половой принадлежности мочи по соотношению в осадке ядросодержащих и безъядерных
клеток. Для этого использован метод последовательного анализа Вальда,
впервые применённый в судебно-медицинской практике С.И. Любинской
(1969) для диагностики половой принадлежности крови.
В основе этого метода лежит рассчитанная с заданной величиной
ошибки вероятность происхождения мочи от женщины или мужчины в зависимости от числа изученных клеток и наличия ядер в них.
14
В связи с относительно небольшой выборкой (препараты мочевого
осадка от 40 мужчин и 60 женщин), для повышения точности диагностики
мы воспользовались данными Р.Б.Котельникова (1986) о том, что теоретически наибольшее и наименьшее отклонения от среднего арифметического значения (М) в выборке (с вероятностью ошибки 0,1%) составляют  3,2σ (среднего квадратического отклонения).
Исходя из этого положения, мы определили наибольшую вероятную
встречаемость ядросодержащих клеток в осадке мужской мочи (43,5%) и
наименьшее вероятное значение выявляемости ядросодержащих клеток в
женской моче (65,6%). Именно эти цифры, а не средние арифметические значения встречаемости ядросодержащих клеток в мужской и женской моче были использованы нами в анализе Вальда.
Проведённые расчёты (с вероятностью ошибки 1%) показали, что происхождение мочи от женщины может быть установлено при обнаружении
всего 5 ядросодержащих клеток из 5 исследованных, а от мужчины – при выявлении 8 безъядерных клеток (из 8 изученных) и т.д. (таблица 2).
Таблица 2
Соотношение ядросодержащих и безъядерных клеток для диагностики
половой принадлежности следов мочи
Число ядросодержащих клеток
(не менее)
Число клеток,
подлежащих
исследованию
Число ядросодержащих клеток
(не более)
Число клеток,
подлежащих
исследованию
женский пол
мужской пол
5
5
0
8
6
8
1
11
7
11
2
14
8
14
3
17
9
17
4
20
10
20
5
23
и т.д.
и т.д.
Для разработки оптимальных вариантов определения групповой принадлежности клеток из осадка мочи по системам АВ0 и MNSs изучено 60 об-
15
разцов мочи от практически здоровых женщин и мужчин в возрасте от 3 до
76 лет всех четырех групп по системе АВ0 и трех групп – по системе MNSs
(А - 22, В - 18, 0 - 16 и АВ - 4 человека; M - 15, N - 15, MN - 30 человек).
Групповую принадлежность клеток устанавливали в соответствии с рекомендациями М.С. Свирского (1967), Н.В. Еранова с соавт. (1971), М.Ш.
Колыш (1977) и Л.А. Тишиновой (1988) с помощью реакции смешанной агглютинации (РСА).
В экспериментах использовали гетероиммунные (анти-M, анти-N, антиН), изоиммунные (анти-А, анти-В) сыворотки и диагностические реагенты с
моноклональными антителами (МКА) анти-M, анти-N, анти-А, анти-В и анти-Н. Фаза абсорбции при 4о продолжалась от 3 до 48 часов в зависимости от
применяемого реагента.
Применено два варианта постановки РСА: с отмыванием (Свирский
М.С., 1969; Загрядская А.П., Ревнитская Л.А., Еранов Н.В, 1972; Стегнова
Т.В., 1976) и без отмывания от несвязавшихся антител по модифицированной
нами методике, предложенной Т.В. Стегновой (1976) для определения групповой принадлежности выделений.
За положительный результат принимали четко выраженную агглютинацию из 2-3 и более тест-эритроцитов, свободно прикрепленных к клеточной мембране.
Учет результатов реакций проводили через 30 минут и 2 часа экспозиции при комнатной температуре.
Критерием специфичности служило отсутствие агглютинации эритроцитов, иногруппных относительно искомого антигена.
Исследования показали, что выявление антигенов А, В и Н системы
АВ0 с помощью РСА не вызывает каких-либо затруднений, как в варианте
постановки реакции с отмыванием, так и без отмывания от непрореагировавших антител.
Наилучшие результаты по выявлению антигенов системы АВ0 были
получены при применении реагентов и сывороток с титром от 1:64 до 1:256.
16
При использовании реагентов с моноклональными антителами (МКА)
анти-А, анти-В, анти-Н с титром более 1:256 во всех опытах наблюдали перекрестные реакции, а применение в реакциях МКА анти-А, анти-В, анти-Н с
титром ниже 1:32 привело к полному невыявлению антигенов.
Антигены системы MNSs были выявлены всего лишь в 90 опытах из
960 при абсорбции антител в течение 48 часов и пятикратном отмывании ледяным физиологическим раствором в вариантах абсорбции как иммунными
сыворотками анти-M и анти-N, так и МКА анти-M и анти-N.
При абсорбции иммунными сыворотками и МКА реагентами анти-M и
анти-N в течение трех часов (укороченный вариант) антигены не были выявлены во всех 480 экспериментах.
При применении МКА с титром 1:256 и выше и при абсорбции в течение 20 часов, наблюдались перекрестные реакции и интенсивное прилипание
эритроцитов к предметному стеклу, а с титром ниже 1:32 антигены не выявлялись.
Сложности определения антигенов М и N системы MNSs, связаны, по
данным Baranowski, Lisowska, Romanovska (1956, 1959), П.Н. Косякова
(1974), М.Н. Резникова (1947), А. Simon (1962), G. Uhlenbruck (1960), с более
слабой иммуногенностью и специфической абсорбционной способностью
антигенов этой системы, что не всегда позволяет определить по ним групповую принадлежность клеток.
В 260 экспериментах изучена устойчивость клеток осадка мочи к воздействию некоторых факторов внешней среды: влажности, высокой и низкой
температуры.
Исследования показали, что нагревание клеток до 180º быстро приводит к изменениям их структуры и уже через 2 часа клетки полностью разрушаются.
При замораживании клеток на протяжении всего срока наблюдения (6
месяцев) выявлялись клетки с чёткими контурами, неповреждённой оболоч-
17
кой, в ядрах которых хорошо различалась хроматиновая структура и половые
метки (Х- и Y-хроматин).
Действие влажности в условиях комнатной температуры оказалось губительным для клеток. Во всех наблюдениях уже в первый час клетки в препаратах хотя и имели неповрежденную структуру, но были сплошь обсеменены микроорганизмами.
Через 2 часа различить структуру клеток было ещё возможно, а через 1
сутки клетки сплошным слоем покрывались различными видами микробов
(кокками, палочками, дрожжевыми грибками и т.д.), из-за чего выявить их
морфологические особенности и хроматиновую субстанцию в ядрах не представлялось возможным.
Полученные нами данные подтвердили результаты ранее проведенных
исследований по изучению действия высоких температур на клетки буккального эпителия (Тишинова Л.А., 1988) и некоторых органов (Еранов Н.В.,
1971), а также на целые органы и мазки-отпечатки с них (Одинцов Н.В.,
1979).
Для решения задачи по определению видовой принадлежности следов
мочи использовались реакция преципитации в агаровом геле и метод встречного иммуноэлектрофореза на мембранах из ацетат-целлюлозы. При этом
оказалось, что видовая принадлежность белка в моче установлена только в
122 наблюдениях из 280 после экстракции физиологическим раствором.
В связи с низкой выявляемостью видоспецифических белков, была
проведена обработка пятен мочи 0,1% растворами трипсина и папаина в соответствии с рекомендациями Р.С. Сахарова с соавт. (1987). Однако даже при
использовании протеаз в 10 опытах из 160 видоспецифические свойства мочи
не были определены.
Поэтому мы разработали методику повышения концентрации белка в
моче, которая состоит в следующем:
- пятно мочи весом более 100 мг помещают в пробирки, заливают физиологическим раствором и накапливают белки способом, подобным накоп-
18
лению агглютининов по T. Marcinkowski (1959) на вертикальных полосках
фильтровальной бумаги;
- верхнюю часть полоски фильтровальной бумаги срезают, заливают
0,1% раствором трипсина или папаина и экстрагируют в течение 20 часов
при 4о;
- в вытяжках реакцией преципитации в агаре или методом встречного
иммуноэлектрофореза на ацетат-целлюлозных мембранах выявляют видоспецифические белки.
При этом во всех 100 опытах наблюдалось выпадение осадков между
всеми подготовленными таким образом образцами мочи и сывороткой, преципитирующей белок человека, как в реакции преципитации в агаровом геле,
так и при встречном иммуноэлектрофорезе на ацетат-целлюлозных мембранах.
Проведенные нами исследования позволили провести дифференцирование клеточного осадка мочи, образованного различными видами эпителия,
установить групповую принадлежность клеток реакцией смешанной агглютинации. Обработка следов мочи протеазами позволили определить видовую
принадлежность в трудно растворимых пятнах.
В связи с полученными данными, мы разработали наиболее рациональную последовательность действий при исследовании пятна мочи при которой
в те же сроки и на одном и том же экспертном материале могут быть получены данные, существенно расширяющие возможности судебно-медицинской
экспертизы вещественных доказательств, в плане конкретизации выводов о
происхождении мочи от определенного человека (рисунок 1).
Навеску пятна мочи в 200 мг экстрагируют физиологическим раствором в течение 20 часов при 4º С, затем вытяжку из пятна разделяют на две
части (осадок и надосадочную жидкость) путем центрифугирования при 1500
об./мин.
19
Пятно мочи
Осадок
Надосадочная жидкость
Половая и
органно-тканевая принадлежность клеток
Вид
(агар, ПАЦ)
РАЭ, КРА
РСА
на клетках с ядрами и без
ядер
МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКОЕ
ИССЛЕДОВАНИЕ
КЛЕТОЧНЫХ
ЯДЕР
Рисунок 1 – последовательность исследования следов мочи на вещественных доказательствах
Надосадочную жидкость используют для определения наличия мочи по
мочевине и креатинину методом восходящей тонкослойной хроматографии
на пластинках силуфоля.
После установления наличия мочи определяют её видовую принадлежность реакцией преципитации в агаре или методом встречного иммуноэлектрофореза на мембране из ацетата целлюлозы. При отсутствии положительного результата следует провести накопление белка на фильтровальной бумаге с последующей обработкой материала протеолитическими ферментами.
Высушенную часть надосадочной жидкости использовать для определения групповой характеристики мочи в реакции абсорбции-элюции.
Осадок, полученный после центрифугирования пятен мочи, исследовать цитологическими методами.
Дальнейшее изучение клеточного осадка позволяет провести групповую дифференцировку клеток по системам АВ0 и MNSs.
В соответствующих случаях при обнаружении ядросодержащих клеток
мочевого осадка возможно проведение молекулярно-генетического исследо-
20
вания, при котором устанавливается происхождение мочи от конкретного
лица.
ВЫВОДЫ:
1. В мужской и женской моче, наряду с эпидермальными чешуйками,
всегда содержатся клетки многослойного плоского неороговевающего эпителия, в ядрах которых выявляются половые маркеры (Х- и Y-хроматин).
2. Для женской мочи характерно наличие клеток влагалищного эпителия, а для мужской – уретрального эпителия, происходящего из ладьевидной
ямки мочеиспускательного канала.
3. Разработан новый способ диагностики половой принадлежности мочи по соотношению в осадке ядросодержащих и безъядерных клеток.
4. Изолированные клетки мочевого осадка, находящиеся в условиях, не
способствующих развитию гнилостных или кариолитических процессов, сохраняются в течение длительного времени.
5. Клетки осадка мочи несут выраженную антигенную характеристику
по системе АВ0, что устанавливается различными вариантами реакции смешанной агглютинации. Более слабая выраженность антигенов системы MNSs
не всегда позволяет определить групповую принадлежность клеток в осадке
мочи.
6. В моче содержится белок в достаточном количестве для установления видовой принадлежности рационально модифицированным методом иммуноэлектрофореза на ацетат-целлюлозных мембранах.
7. Разработана комплексная методика исследования следов мочи на
вещественных доказательствах с использованием цитологических методов
исследования, позволяющая разрешить вопрос об их индивидуализирующей
характеристике.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для диагностики половой и органно-тканевой принадлежности следов мочи необходимо приготовить цитологические препараты.
21
С целью установления половой принадлежности клеток мазки окрашивают раствором 0,0005% раствором акрихина.
Для определения органно-тканевого происхождения клеток по цитохимическим особенностям используют 0,01% раствор акридинового оранжевого, селективно окрашивающий ДНК и РНК.
При дифференцировании клеток различных видов многослойного
плоского неороговевающего эпителия применяют 0,05% раствор амидочерного 10Б, избирательно окрашивающий белки.
С целью подтверждения происхождения клеток из слизистой оболочки
влагалища для выявления гликогена используют окраску раствором Люголя.
При недостаточном количестве клеток с половыми маркерами (X- и Yхроматином) целесообразно использовать способ определения половой принадлежности мочи по соотношению ядросодержащих и безъядерных клеток
(таблица 2).
2. Во всех случаях при проведении реакции смешанной агглютинации
целесообразно изучать параллельно образцы мочи заведомо известных групп
по системам АВ0 и MNSs, а также использовать не менее двух серий диагностических реагентов и сывороток. Рекомендуем одновременно исследовать
объекты двумя модификациями РСА (с отмыванием и без отмывания) при
выявлении антигенов системы АВ0, изменять время абсорбции в сторону
удлинения при определении антигенов системы MNSs.
3. С целью установления видовой принадлежности мочи используют
реакции преципитации в твердой среде, а при отрицательном результате метод иммуноэлектрофореза на ПАЦ.
Наиболее оптимальными для выявления белка при большой давности
следов являются: навеска пятна мочи не менее 200 мг, накопленная на фильтровальной бумаге, экстрагированная в 0,1% раствор папаина или трипсина и
использование
метода
целлюлозной пленке.
встречного
иммуноэлектрофореза
на
ацетат-
22
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Ревнитская Л.А. К вопросу об установлении видовой и половой принадлежности мочи / Л.А. Ревнитская, С.Ю. Силкина // Актуальные проблемы
морфологии: сб. научн. трудов.- Красноярск, 2003. - С.178-181.
2. Ревнитская Л.А. К вопросу о видовой принадлежности мочи / Л.А. Ревнитская, С.Ю. Силкина // Актуальные проблемы судебной медицины: сб. научн.
трудов РЦ СМЭ МЗ РФ. - М., 2003. - С.148-149.
3. Силкина С.Ю. К вопросу о комплексном исследовании мочи / С.Ю. Силкина, Л.А. Ревнитская // Материалы шестого Всероссийского съезда судебных медиков: «Перспективы развития и совершенствования судебномедицинской науки и практики» (посвященные 30-летию Всероссийского
общества судебных медиков). – Москва – Тюмень: издательский центр «Академия», 2005. - С.263.
4. Силкина С.Ю. К вопросу о действии высоких и низких температур на эпителиальные клетки, содержащиеся в моче / С.Ю. Силкина // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики. - Новосибирск: «Межрегиональная ассоциация «Судебные медики Сибири», 2006.- Вып.11. - С.265267.
5. Силкина С.Ю. Один из способов определения видовой принадлежности
мочи в следах на вещественных доказательствах / С.Ю. Силкина // Актуальные вопросы судебной медицины и экспертной практики на современном
этапе: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием посвященной 75-летию РЦ СМЭ. - М., 2006. - С.500.
6. Силкина С.Ю. Особенности клеточного состава мочи лиц мужского и женского генетического пола / С.Ю. Силкина, Л.А. Ревнитская // Сборник работ
врачей судебно-медицинских экспертов-биологов РЦСМЭ. – Вып. 4. – М.,
2007. – С.28-30.
7. Силкина С.Ю. Новые технологии исследования мочи в следах на вещественных доказательствах / С.Ю.Силкина // Нижегородский медицинский
23
журнал. - № 6. – 2007. – С.81 – 84. – Дополнение к перечню – редакция июль
2007 г.
8. Силкина С.Ю. «Способ определения половой принадлежности мочи при
судебно-медицинской экспертизе следов мочи» / С.Ю.Силкина, Н.С.Эделев положительное решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам о выдаче патента на изобретение от
11 марта 2008 года заявки № 2007108948/15 от 13.03.2007 г.
24
Силкина Светлана Юрьевна
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Подписано к печати 23.06.08 г. Формат 60х80
Бумага писчая. Печать офсетная.
Усл.печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 98
Полиграфический участок ГОУ ВПО НижГМА
603005, Н.Новгород, ул. Алексеевская, 1.